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La hormona del crecimiento II

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El verano pasado publicamos un extenso artículo sobre la hormona de crecimiento. En nuestros foros se discute mucho sobre las marcas, los precios y la calidad del GH, especialmente el de origen chino. Generic Supplements, un laboratorio subterráneo holandés, había hecho varios análisis a través de nosotros para encontrar un fabricante de API (polvo crudo) constante y fiable. Cuando me pidieron que intentara encontrar un laboratorio que fuera capaz y estuviera dispuesto a analizar hormonas peptídicas complejas, porque querían analizar una versión genérica de GH china, me mostré muy escéptico. A partir de la investigación del artículo anterior sobre la hormona de crecimiento supe que GeneScience tenía la patente en China para la fabricación de GH mediante la tecnología de secreción. Y este método es el único que produce 191 aminoácidos GH con alta pureza. Cuando nos ofrecieron una muestra en enero de 2006, la tomamos, y teníamos mucha curiosidad por saber el contenido. Terminamos sorprendidos por los resultados. 

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Hay cerca de 7 lugares que fabrican polvo de HGH en un laboratorio en China, principalmente la variante de 192 aminoácidos conocida como somatrem. En los tableros de discusión se discute mucho sobre las tapas azules o rojas, pero esto no significa nada, ya que nadie está seguro de cuál es la que se obtiene, ni de dónde fue empaquetado. Estos frascos y tapas están disponibles y se utilizan para el envasado de todo tipo de péptidos. Todo el mundo habla de GeneScience Jintropin y su calidad, pero su principal técnico dejó GenSci hace un año. Todavía es dueño del 6% de la compañía, pero se dice que se fue debido a una disputa. Desde entonces ha comenzado a producir el polvo genérico de HGH, que es la hormona de crecimiento correcta de 191 aminoácidos (somatropina), aunque se hace sin licencia de GMP. Este individuo está vendiendo la tecnología y los polvos a muchas personas, y por consiguiente hay muchas nuevas marcas de HGH ahora en circulación. Gran parte de ella hace uso de este polvo legítimo, pero ¿son todos los productos hechos de él de calidad aceptable? La respuesta, por supuesto, es no.

El problema clave del HGH es el embalaje. No puede ser empacado en una cocina. No puede ser empacado en un simple laboratorio con una sala limpia básica o un sistema climático iso9001 (suficiente para la producción de tabletas). Debe hacerse en un área controlada muy específica con la maquinaria adecuada. De lo contrario, el polvo, aunque sea bueno en sí mismo, puede degradarse y causar ronchas o problemas en el punto de inyección cuando se administra. El polvo no puede permanecer mucho tiempo expuesto al aire, incluso la pequeña cantidad atrapada dentro de un vial al producirlo. El problema de una licencia GMP en China es que no está centralizada. Cada provincia tiene su propio personal de GMP de la SFDA. Hygetropin, por ejemplo, tiene un certificado real de GMP, que puede ser comprobado en el sitio web de la SFDA. La FDA china sólo permite 8IU, por lo que ese sería el artículo aprobado. Una forma de Hygetropin se hace con 10IU, pero se produce sólo para la exportación sin la aprobación de la SFDA. Esto va para todos los fabricantes chinos.

Así que, con todos estos diferentes productos y regulaciones, ¿cómo puedes decir que tienes un producto de calidad HGH? Una forma de averiguar si el polvo está correctamente empacado es prestar mucha atención cuando se agrega el diluyente al frasco de polvo. Cuando perforas la aguja (es preferible una pequeña aguja de insulina) a través del tabique de goma, el agua debe ser aspirada en el vial sin necesidad de empujar el émbolo. Esto se debe a que fue empaquetado correctamente sin aire, pero con un vacío de baja presión, en el interior. Literalmente aspirará el diluyente para llenar el vacío. Si necesitas apretar la jeringa para inyectar el líquido para poder entrar, no es una buena señal. Probablemente significa que hay aire dentro del vial, y que tu polvo se ha degradado hasta cierto punto.

En el foro se discutió mucho sobre este tipo de temas y decidimos realizar más análisis sobre la hormona de crecimiento china. Estos son los más comunes:

Dejamos la elección a nuestros miembros, y ellos eligieron la Hygetropina. Realizamos algunos análisis en esta muestra también y comparamos las muestras juntas.

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Figura 2

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Estos son los datos en bruto de nuestro análisis. El MW de la proteína se determinó como 22093 Da en el modo lineal de MALDI-MS. Esto es un poco más alto que el MW calculado (21880 Da). La diferencia podría deberse a las oxidaciones en las metioninas. La secuencia de aminoácidos debería estar bien. Esto también se confirma por la huella dactilar de masa peptídica (PMF). También medimos el PMF en modo lineal porque algunos de los péptidos resultantes son bastante largos y, por lo tanto, no son visibles en el modo de reflector de MALDI-MS.

No mostraremos todos los gráficos en este artículo porque esto sólo funcionaría confundiendo al lector. Lo que hicimos fue una comparación de los resultados de la muestra de Suplementos Genéricos con la nueva muestra de Higiene.
 

Figura 3 

Los espectros de masa peptídica de ambos productos de hHGH son similares. La figura 3 es una superposición de los dos espectros separados en dos rangos de masas diferentes. En la parte inferior se ve la nueva muestra (Higiene), en la parte superior la antigua muestra (Suplementos genéricos). Ambos, el péptido N-terminal (930,5 Da), y el péptido C-terminal a 842,4 Da son visibles en ambos espectros. El último es difícil de resolver porque está superpuesto por una señal dominante a 844,5 Da. Por lo tanto, podemos decir que al menos una parte de la molécula tenía los terminales N y C correctos. Un Met-hGh puede ser excluido ya que no vimos el péptido N-terminal a 1061,5 Da. Des-Phe1-hGh también puede ser excluido debido a la falta del péptido N-terminal en 783,4 Da. Sin embargo, también hay diferencias dentro de ambas muestras. Por ejemplo, la masa a 1628,9 Da sólo está presente en la nueva muestra, y no se explica por el digesto teórico. La masa de 1274,6 Da está tremendamente aumentada en la segunda muestra. La masa 1438,7 Da sólo está presente en la antigua muestra, también las grandes masas, 3957,9 Da, y 4086,0 Da. Todas estas masas no están explicadas por el resumen teórico. Podríamos hacer MALDI-MS/MS para obtener las secuencias correspondientes, si se quiere… Pueden ser errores en la secuencia correcta, modificaciones en la secuencia esperada, o contaminaciones. El péptido diferencial a 1490,7 Da se deriva de la tripsina.

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Figura 4

Hemos leído sobre el resumen teórico, pero ¿entendemos lo que significa? En el cuerpo, esta hormona de crecimiento humana recombinada es una cadena larga de 191 aminoácidos, con una masa molecular o peso molecular de 22 KDa, 22000 Dalton o 22 KiloDalton. Esta hormona se digiere enzimáticamente en diferentes fragmentos. Estos fragmentos tienen una cierta secuencia de diferentes aminoácidos y el peso que se relaciona con ella. A la izquierda verán un gráfico de la hormona de crecimiento humano. Para facilitar la comprensión, coloreamos los diferentes fragmentos en diferentes colores (Figura 4). Cuando los analistas encuentran en el gráfico masas que no deberían estar ahí debido a la digestión teórica, se refieren a estas masas como “no explicadas por la digestión teórica”.

¿Son estos resultados suficientes para usted o quiere que confirmemos las secuencias de péptidos seleccionados por MALDI-MS/MS?

Queríamos estar seguros, por eso le pedimos al laboratorio que identificara estas masas inesperadas por medio de la MALDI-MS/MS.

MALDI-MS/MS

Las proteínas intactas se ionizan mediante desorción/ionización por láser asistida por matriz (MALDI), y luego se introducen en un analizador de masas. En el segundo, las proteínas se digieren enzimáticamente en péptidos más pequeños usando un agente (tripsina). La colección de productos peptídicos se introdujo entonces en el analizador de masas. El análisis de masa de proteínas enteras se lleva a cabo principalmente utilizando un tiempo de vuelo (TOF) MS, o la resonancia de ciclotrón de iones por transformación de Fourier (FT-ICR). Estos dos tipos de instrumentos son preferibles aquí debido a su amplio rango de masas, y en el caso de la FT-ICR, su alta precisión de masa. El análisis de masa de los péptidos proteolíticos es un método mucho más popular de caracterización de proteínas, ya que para la caracterización se pueden utilizar diseños de instrumentos más baratos. Además, la preparación de las muestras es más fácil una vez que las proteínas enteras han sido digeridas en fragmentos de péptidos más pequeños. La EM en tándem (EM/EM) se está convirtiendo en un método experimental más popular para la identificación de proteínas. La disociación inducida por colisión se utiliza en las principales aplicaciones para generar un conjunto de fragmentos de un ión peptídico específico. El proceso de fragmentación da lugar principalmente a productos de ruptura que rompen los enlaces peptídicos. Debido a esta simplicidad en la fragmentación, es posible utilizar las masas de fragmentos observadas para hacerlas coincidir con una base de datos de masas predichas para una de las muchas secuencias peptídicas dadas.

Aquí están las coberturas de las secuencias de los espectros de los resultados de la MALDI-MS/MS de las masas peptídicas inexplicadas. Dos de ellos (1252,6 y 2726,3) resultaron ser péptidos de somatotropina mal divididos con buenas puntuaciones. El tercero (1380,7) se identificó como de la proteína ASAH (ver la consulta de la base de datos), pero la puntuación fue muy baja, por lo que creo que este es un resultado positivo falso. Compara la cobertura de la secuencia (importante son los iones ‘b’ e ‘y’) de los dos péptidos de somatotropina con la del tercer péptido (1380,8 Da). En los primeros espectros casi todas las señales se explican por y- o b-iones. En el tercer espectro muchos picos no se explican en absoluto, por lo que el resultado es probablemente erróneo. Todos los demás péptidos tuvieron puntuaciones bajas, y no me creería las puntuaciones de la mascota de > 30. Y una puntuación de la mascota inferior a 30 es un límite para un umbral que se puede creer o no. Se consideran falsos positivos.

Figura 5

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Los péptidos mal cortados que identificamos fueron muy probablemente generados durante la digestión tríptica. No explican nada sobre las diferencias de calidad en los diferentes lotes. Se producen debido a condiciones ligeramente diferentes durante la digestión tríptica. Si digerimos las bandas de SDS-PAGE no sabemos exactamente el contenido de proteínas de estas bandas. Por lo tanto, les añadimos una cantidad estandarizada de tripsina. Dependiendo de la cantidad real de proteína hay diferentes ratios de proteína/tripsina en diferentes muestras. Esto puede dar lugar a que se produzcan más errores de separación (no sitios de separación en K o R) que en las muestras con una menor concentración de tripsina. Además, la temperatura, el pH, el tiempo de incubación, etc. son otros factores que influyen en la digestión. Así que, aunque encontremos péptidos divididos de forma diferente, las muestras de proteína originales pueden ser idénticas. Lo único que nos permite diferenciar entre las muestras serían los péptidos derivados de otras proteínas (contaminaciones), o los péptidos que son diferentes en su secuencia en comparación con la secuencia original. Sin embargo, no hemos sido capaces de identificar este tipo de péptidos. Esto podría indicar que ambas muestras son, en efecto, bastante puras. Tal vez debería enviarnos una muestra menos pura, entonces deberíamos ver fácilmente las diferencias, incluso en SDS-PAGE.

La SDS-PAGE no muestra contaminaciones o contaminaciones [en Hygetropin].

Sitios web informativos independientes sobre la hormona de crecimiento

Un nuevo fenómeno parece ser los sitios web de investigación informativa sobre la hormona de crecimiento humano. Estos sitios web a menudo provienen de los fabricantes chinos, por ejemplo www.hgh-research.com y www.somatropin.net. Parece que un grupo de fabricantes chinos de la hormona de crecimiento realmente lanzó este último sitio web. Este sitio web quiere “informar a los usuarios y oponerse al abuso de la hormona de crecimiento”, según un mensaje de prensa. Pero el sitio web es en realidad un ingenioso instrumento de marketing de GeneScience, el fabricante de la marca de la hormona de crecimiento Jintropin. El mensaje de prensa que anunció el lanzamiento de somatropin.net es sorprendentemente honesto acerca de quiénes son los usuarios más importantes de la hormona de crecimiento. No son los niños con deficiencia de hormonas de crecimiento, sino los atletas, culturistas y los fanáticos del anti-envejecimiento.

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La explicación sobre el uso de la hormona de crecimiento enfatiza los efectos positivos, y presta comparativamente poca atención a los efectos secundarios: “La HGH puede promover el crecimiento de los músculos magros y la pérdida de peso, puede aumentar la energía, acortar el tiempo de recuperación entre los entrenamientos, curar el tejido dañado y fortalecer las articulaciones y los ligamentos. La HGH también se usa comúnmente como una droga antienvejecimiento para prevenir y reparar el daño responsable de la piel arrugada, la osteoporosis y la pérdida de memoria”. Eso no es información. Eso es publicidad, y una simplificación excesiva en su forma más pura. Todo el mundo sabe que el envejecimiento viene con una disminución de los niveles hormonales. Sólo para complementar la hormona de crecimiento hasta que se alcancen los niveles de juventud no se desharán los signos de envejecimiento. Eso haría de la hormona de crecimiento la fuente de la juventud, lo cual no es así.

No está claro quiénes son las personas que están detrás de somatropina.net. En un mensaje de prensa en el sitio están los nombres de tres compañías: GeneScience Pharmaceuticals, Neogenica BioScience y AnkeBio. Neogenica es la más destacada presente en el mensaje de prensa, ya que el mensaje cita a “un portavoz” de Neogenica, mientras que después de esto no se cita a nadie más. “Básicamente queremos detener

Las estafas de HGH, previenen el abuso y educan a la gente sobre lo que la HGH puede y no puede hacer por ellos”, según la información de Neogenica. Para el resto no encontrarás información sobre Neogenica en www.somatropin.net. No hay duda de por qué. Neogenica no vende ninguna hormona de crecimiento, sino sólo IGF-1. Neogenica lanzó su preparado de IGF-1 LR3 Revitropin en marzo de 2006.

Y no hay duda de que es un producto destinado especialmente a los culturistas.

“El FGI es más efectivo en causar directamente el crecimiento muscular y el aumento de la densidad”, afirma Neogenica. “El IGF es también mucho más rentable”. Neogenica envía sus productos “de manera discreta”. También es un hecho agradable de saber. ¿Pero cómo está involucrada Neogenica en somatropina.net? Bueno, parece que Neogenica está directamente ligada a GeneScience. El mensaje de prensa sobre la introducción de Revitropin por parte de Neogenica fue escrito por David García. Ese nombre es la persona que registró somatropin.net. La información puede ser verificada por una búsqueda rápida en whois.org. Pero este David también tiene una dirección de correo electrónico, que termina yendo a una cuenta en genescience.cn. GeneScience solía vender LR3-IGF-1, bajo la marca Igtropin. Es mi creencia que la Igtropina es lo mismo que la Revitropina, sólo que ahora porque es un producto dirigido a los culturistas no está asociado con GeneScience, al menos públicamente. No importa qué, una vez que sabes quién controla el sitio web somatropin.net, te das cuenta de lo ingenioso que es este sitio web y cuál es la verdadera intención de este sitio. Somatropin.net es un instrumento de mercadeo, que pone a la competencia en una mala posición y lleva a los lectores/clientes a comprar productos de GeneScience. En somatropin.net encontrará una comparación de precios. Un vistazo rápido y verá que las marcas europeas son demasiado caras.

Si ves la diferencia de precio, el mensaje es claro, “debes estar loco para comprar esos en lugar de los productos chinos”. Ansomone de AnkeBio, o Fitropin de Kexing, también son baratos. Pero en la primera página el sitio web le dice al visitante que esos compuestos, al igual que la Tev-Tropina de Farmacéuticas Teva, no contienen somatropina real, sino sólo somatrem.

Una vez más, el somatrem es una variante más antigua de la hormona de crecimiento, que contiene un aminoácido más que la hormona de crecimiento endógena, y se considera menos eficaz. Además, el sitio web revela que Fitropin de Kexing no es somatropina. “Debido a que GeneScience Pharmaceutical Co., Ltd. tiene la patente para fabricar HGH por tecnología de secreción en China, Kexing no puede fabricar su producto a través de un medio tan puro y efectivo”. Si usted quiere la hormona de crecimiento real 191aa, y no quiere pagar más de unos pocos dólares por una UI, entonces sólo tiene una opción de acuerdo con el sitio web, Jintropin de GeneScience.

Lo que no te dicen es que hay más hormonas de crecimiento genéricas chinas, y marcas más baratas, por ejemplo, como Hygetropin. Esta parece ser igual de buena según nuestros análisis. Algunos miembros incluso han afirmado que el efecto de Jintropin era a veces menor que el de otras marcas, incluso dudando de su calidad. Por eso hemos enviado una muestra de Jintropin y una muestra de Suplementos Genéricos al departamento de toxicología de una universidad muy famosa, donde un profesor doctor analizará las muestras cuidadosamente para detectar contaminaciones y pureza de péptidos. Encontrará los resultados en nuestro próximo número.

Hasta entonces no haremos ningún comentario negativo sobre Jintropín. Pero es por eso que agregamos la Hygetropina a nuestra comparación de precios. Desde que John dejó GeneScience, es mi opinión que un producto que usa su polvo como Hygetropin es tan bueno como el de cualquier otro fabricante certificado.

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